免疫学检验知识点整理

1 免疫学基本概念及其生物学功能
免疫:机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能
免疫三大功能:免疫防御、免疫自稳、免疫监视
中枢免疫器官(骨髓和胸腺)外周免疫器官(淋巴结、脾脏、扁桃体)
免疫细胞:淋巴细胞(T,B,NK)、单核巨噬细胞、其他免疫应答细胞(中性粒、嗜酸性、嗜碱性和肥大细胞)
免疫分子:免疫球蛋白(IgM,IgG,IgA,IgE,IgD),补体,细胞因子,细胞黏附分子,人类白细胞分化抗原
免疫应答:机体免疫系统接受抗原刺激发生的一系列反应,并以排出或分解该抗原为目的的反应过程。过程:抗原的识别、处理、信息传递(识别阶段),免疫细胞的激活、增殖、分化(活化阶段)以及产生一系列的免疫效应因子(效应阶段)。

临床免疫学检验:研究免疫学检测理论、技术、应用,免疫疾病发病机制、免疫诊断、及防治的一门医学领域的应用学科。
免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应,免疫学技术有凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应、中和反应和标记免疫反应五种类型。
免疫检验:1)利用免疫检测原理和技术检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因子、细胞黏附分子等免疫相关物质;2)体液中的微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素。

临床免疫学:利用免疫学理论和技术研究疾病的免疫病理机制、诊断和鉴别诊断、疗效评价、预后判断和预防的多个分支学科的总称。
免疫性疾病:各种原因引起的机体免疫应答异常所致的疾病,包括超敏反应性疾病、自身免疫病、免疫缺陷病和免疫增生病。
感染免疫学:研究病原微生物与宿主相互关系从而控制感染的学科,传统免疫学核心。
肿瘤免疫学:研究肿瘤免疫原性、机体抗肿瘤的免疫效应及机体的免疫功能与肿瘤发生、发展的相互关系以及肿瘤免疫诊断与防治的学科。
移植免疫学:研究移植物与宿主相互关系从而选择移植物和延长移植物存活的学科。

2 血清学反应的概念
抗体主要存在于血清中,体外的抗原抗体反应称为血清学反应。
抗原抗体反应:抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应,特异性取决于抗原表位和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性,并通过静电引力、范德华引力、氢键结合力和疏水作用力等非共价键结合在一起。

3 抗原抗体的反应原理
Ag决定簇和Ab分子超变区分子间的结构互补性;分子表面特异的可逆的弱结合力;亲水胶体转化为疏水胶体
* 亲和力(affinity) 是抗体分子上一个抗原结合点与对应抗原表位之间相互适应而存在的引力。这是抗原与抗体之间固有的结合力。
* 亲合力(avidity) 是指反应系统中整个抗原分子与相应抗体之间的结合能力。
亲和力与亲和性、抗体的结合价和抗原的抗原决定簇数目相关。亲和力越大,抗原抗体结合越牢固。
K=抗原抗体复合物浓度/(游离抗原浓度*游离抗体浓度)
K值大的抗体与抗原牢固结合,不易解离,说明该抗体有高亲和力。
亲水胶体转化为疏水胶体:血清学反应条件下,抗原抗体均带负电荷,使极化的水分子在其周围形成水化层,成为亲水胶体。
当抗原与抗体结合后,表面电荷减少,水化层变薄,失去亲水性能,抗原抗体复合物成为疏水胶体。 电解质作用下,中和胶体表面电荷,使疏水胶体靠拢,形成可见的抗原抗体复合物。

4 抗原抗体反应的特点
特异性:抗原与抗体结合反应的专一性。分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性
交叉反应:两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位,可与彼此相应的抗血清发生反应
可逆性: 解离后抗原抗体仍保持原有理化性质和生物活性。
影响因素:抗体与抗原间的亲合力,亲合力越高,结合越牢固,越不易解离;环境因素-pH、离子强度
比例性:抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系。前带(prezone):抗体过量。后带(postzone):抗原过量。等价带(equivalence zone):抗原抗体比例合适
阶段性:亲水胶体转疏水胶体的化学和物理变化过程:抗原抗体特异性结合(几秒至几分钟,不出现可见反应),非特异性促凝集(抗原-抗体复合物在适合温度pH电解质等环境因素影响下,进一步交联和聚集,出现肉眼可见沉淀、凝集、细胞溶解等反应,数分钟至数小时)
【熟悉免疫学发展简史;抗原及免疫球蛋白的定义及功能

5 抗原抗体的反应影响因素
反应物自身因素: *抗原:1.理化特性2.Ag决定簇数量3.Ag决定簇种类 *抗体:1.来源2.特异性与亲和力3.浓度
环境条件:*电解质:0.85%NaCl*使[ Ag-Ab ]表面的电势下降,失去电荷,破坏水化层,形成凝集或沉淀。浓度过高出现盐析。
酸碱度:pH6~9*酸凝集:当pH为3左右时,接近细菌Ag的等电点,可出现非特异性凝集。
蛋白质具有两性电离性质,每种都有固定的等电点。反应液中pH过高或过低都可影响抗原或抗体的理化性质。
温度:15~40℃,冷凝集为4℃。在一定范围内,温度增高,分子运动加快,反应速度加快,但结合不牢固,易解离;温度低,反应速度慢,但结合牢固。

6 抗原抗体反应的类型

沉淀反应;凝集反应;补体参与的反应;中和反应;免疫标记

免疫原和抗体的制备(免疫原和抗血清的制备;单克隆抗体与基因工程)

1 免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质,与载体结合后可具有免疫原性。
2 特异性IgG抗体的纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等;制备单价特异性抗血清可采用亲和层析法和吸附剂方法。
1 可溶性免疫原制备:粗提——组织匀浆制备,细胞的破碎
2 可溶性免疫原提纯:超速离心法,选择性沉淀法,凝胶层析法,离子交换层析法,亲和层析法,电泳法

1 多克隆抗体的概念

由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的抗体,是多种抗体的混合物。
抗血清是经过抗原免疫的动物血清。在含有多种抗原表位的抗原刺激下,体内多个B细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的抗体,其混合物为多克隆抗体。

2 多克隆抗体的制备流程
免疫原(及佐剂)的制备;免疫动物(动物选择和动物免疫);试血;采血收集血清;抗血清的鉴定;抗血清的纯化;抗血清的保存

3 免疫佐剂的概念、常见种类及作用机制
免疫佐剂是先于抗原或与抗原一起注入机体,可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质。
氢氧化铝,明矾,弗氏佐剂(Freund adjuvant),脂质体,细胞因子(乳化方式:研磨法:易乳化,但抗原或佐剂用量大。搅拌混合法:无菌操作,节省抗原或佐剂,但不易乳化完全)
作用机制:1.改变抗原的物理性状,使抗原在体内滞留或延缓释放,延长抗原与免疫细胞作用的时间,从而增强抗原免疫原性。2.抗原在佐剂的辅助作用下,更易被巨噬细胞有效吞噬和有效的加工处理和呈递。3.刺激单核-巨噬细胞活化,释放细胞因子调节和增强淋巴细胞的应答能力。4.刺激淋巴细胞增生分化,从而增强和扩大免疫应答能力。
应用佐剂的缺点:佐剂常混有微量其它物质,这些物质进入体内后也可引起抗体的产主,影响抗血清的特异性;注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌性脓肿;反复注射,易发生超敏反应,使局部组织坏死,甚至引起动物死亡。

4 免疫血清制备
动物的选择 1.抗原与免疫动物种属差异越远越好; 2.动物个体选择: 适龄、健壮、无感染正常动物、体重合乎要求;3.抗原性质:酶类—豚鼠;甾体激素—家兔 4.血清用途: R型:等价带宽,适于诊断试剂.用家兔免疫产生. H型:等价带窄,适于免疫治疗.用马免疫产生.5.抗血清需要量选择

免疫方法1.免疫剂量:1)不能过大或过小,否则产生免疫耐受;2)首次免疫剂量不宜过大3)大:0.5-1mg/只 小:0.1-0.6mg/只
免疫途径:1)皮内或皮下注射: a.采用多点注射(8-10点); b.半抗原宜皮内多点注射; c.皮内注射易引起细胞反应,对提高抗体效价有利,但皮内注射较困难(因佐剂加入后粘度大)。2)腹腔和静脉注射:  多用于颗粒性抗原和加强免疫。3)淋巴结内注射:  适宜于微量抗原(先用完全佐剂在足掌作基础免疫)。
免疫时间:1)间隔约10-20 天(宜长、否则导致免疫耐受);2)二次以后每次间隔7~10天(过长→刺激变弱→ 抗体效价不高。)3)一般接种5-8次,不超过2个月;4)半抗原的免疫间隔要求较长(30~40天)。如 8次免疫后仍不产生抗体,则应更换动物。
采血及试血颈动脉采血法:家兔、绵羊、山羊;心脏采血法: 家兔、豚鼠、大鼠、鸡 ;静脉采血法: 家兔、山羊、绵羊
免疫血清的纯化:免疫血清是成分复杂的混合物,除有特异性和非特异性抗体,还有各种蛋白成分
抗血清——硫酸铵盐析多次(粗提)——亲和层析,离子交换层析,凝胶过滤——IgG类抗体(不纯)——亲和层析,吸附法——特异性IgG抗体
抗体的鉴定:1.效价的鉴定:抗体含量测定。 根据抗原性质不同,颗粒性抗原可采用凝集试验。可溶性抗原常用免疫双扩散法 2 抗体的纯度鉴定:SDS-PAGE。若只出现一条蛋白电泳区带说明抗体纯化已达到要求,而出现多条蛋白区带则表明抗血清中混有杂蛋白,必须进一步纯化。 3.特异性鉴定:抗体对相应或相似抗原识别能力 一般用特异性抗原及其相似的抗原与待鉴定抗体进行免疫双扩散试验。如果出现交叉反应,说明有杂抗体存在。可应用相应抗原吸收杂抗体,即可得到单价特异性抗体。4 抗体亲和力鉴定:亲和力高则灵敏度好:亲和力测定主要有平衡透析法、酶联免疫法和放射分析法。亲和力的高低是由抗原分子和抗体分子的结合位点、抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。

免疫血清的保存:1.4℃保存:可保存3~6个月 2.低温保存:-20~-40℃,可保存2~3年。抗体的保存浓度为20~30mg/ml为宜,加入1/10000的硫柳汞或1/1000的叠氮钠防腐,并加入等体积的中性甘油,分装小瓶,置-20℃以下低温保存。 3.冰冻干燥保存:可保存5~10年

5 单克隆抗体的概念
每一克隆B细胞所产生的理化性状高度均一、组成均一、只与同一种抗原决定族反应的抗体。

6 淋巴杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术:在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

7 单克隆抗体的制备流程
1、亲本细胞的选择(骨髓瘤细胞:BALB/C小鼠骨髓瘤NS-1细胞株和SP2/0细胞株,致敏B细胞:免疫脾细胞,每次抗原用量100μg)2、细胞融合(细胞融合剂——PEG种类:分子量1000、1500、4000的PEG是最常用的细胞融合剂;作用机理:诱导细胞膜上脂类物质结构重排,使细胞膜易打开而有助于细胞融合;作用特点:随机发生的,不同厂商、批号、分子量的PEG,其纯度与毒性有所不同。)3、杂交瘤细胞的选择性培养基,筛选与克隆化

3凝集反应
1凝集反应的原理及特点;
定义:细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒性载体与相应抗体结合后,可出现肉眼可见的凝集现象。
概念:颗粒性抗原 + 相应抗体↓(适量电解质)凝集现象,可溶性抗原(或抗体) + 载体颗粒↓ 致敏颗粒+相应抗体(或抗原)↓(适量电解质)凝集现象
特点:1.抗原为颗粒性抗原或可溶性抗原致敏颗粒;2.反应时间较短,需几到十几分钟;3.反应产物为凝集块;4.凝集反应抗原分子大,反应面积小,为使抗体分子不致过多,试验时需稀释抗体 。

2 常见的直接凝集反应;

直接凝集试验:颗粒性抗原在有电解质的参与下,直接与相应抗体结合出现的凝集现象。
凝集原(agglutinogen):凝集反应中的抗原
凝集素(agglutinin):凝集参与反应的抗体
分类:玻片凝集实验(将已知抗体与待测颗粒抗原直接低价在玻片上,混匀并在室温下反应数分钟,用肉眼或低倍镜观察有无凝集现象,出现颗粒凝集的为阳性反应。方法评价:简便、快速;定性检测方法;       但敏感性较低。临床应用:主要用于菌种鉴定和血清学分型,也可检测病人血清中有无相应的抗体;用于人类ABO血型鉴定。),试管凝集实验(颗粒性抗原(如细菌或红细胞等)与相应抗体在试管中直接结合,在一定条件下,出现肉眼可见的凝集现象。方法评价:经典的半定量试验;敏感性不高;干扰因素多,影响特异性;操作较简单。临床应用:用已知抗原测定血清中有无相应抗体及其含量,辅助临床诊断疾病或流行病学调查。如外斐试验、肥达试验、交叉配血试验。)

3 间接凝集反应的分类及常见试验。
间接凝集试验:将可溶性抗原(或抗体)吸附或偶联于载体上,使之成为致敏载体颗粒,再与相应抗体(或抗原)作用,在适宜电解质的参与下,出现的凝集现象。
载体(carrier):试验体系中与免疫无关的颗粒。
致敏:抗原(或抗体)偶联于颗粒表面的过程。
致敏颗粒(sensitized particle): 吸附有已知抗原或抗体的颗粒。
(正向间接凝集反应:用抗原致敏载体,检测标本中有无相应抗体。先将可溶性抗原结合与载体颗粒,然后与待测标本中的抗体反应,出现肉眼可见凝集颗粒或块。反向简洁凝集反应:用特异性抗体致敏载体,检测标本中有无相应抗原。简洁凝集抑制反应:用抗原致敏载体,联合相应抗体检测标本中是否存在于致敏抗原相同的抗原。
协同凝集反应:金黄色葡萄球菌的细胞壁中含有A蛋白(staphylococcus protein A,SPA),SPA具有与IgG的Fc段结合的特性,利用该特性与IgG抗体相连制成抗体致敏的颗粒载体,当它与相应抗原反应时出现的凝集现象即叫协同凝集试验。
类风湿因子检测: 原理::类风湿因子( rheumatoid factor RF)是由于细菌、病毒等感染因子,引起体内产生的以变性IgG(一种抗体)为抗原的一种自身抗体。IgM型为主要类型.
IgG吸附于聚苯乙烯胶乳颗粒上作为检测试剂,在反应介质中,待检血清中如含有RF,可与胶乳颗粒出现凝集反应。
操作步骤::在3块载玻片上分别加一滴RF阳性血清、RF阴性血清及待检血清;加一滴IgG致敏的胶乳于各血清样品中,轻微晃动载玻片混匀.;1min 后观察凝集反应发生情况.
注意事项:器材要洁净、血清要新鲜、以确保结果可靠.;注意阴性、阳性对照的设立.;注意血清及致敏胶乳加样量的比例.)
红细胞为载体:间接血凝试验(可溶性抗原吸附于人O型红细胞或绵羊、家兔红细胞上,制备成抗原致敏的红细胞,然后与相应抗体作用,在有电解质存在的条件下,作用一定时间后可出现肉眼可见的红细胞凝集现象。方法评价:敏感性高于直接凝集试验和胶乳凝集试验;操作简便易行、快速、成本低廉。)
聚苯乙烯胶乳微粒为载体:胶乳凝集试验
间接凝集反应特点:敏感、快速、操作简便、不需特殊仪器;检测范围广(各种抗体和可溶性抗原)。敏感性比直接凝集反应高。
间接凝集反应应用:抗原的检测:抗体的检测:感染性疾病、自身免疫性疾病、变态反应性疾病。

4抗球蛋白试验原理及应用;
利用抗球蛋白抗体作为第二抗体起桥联作用,链接与红细胞表面抗原结合的特异抗体,使红细胞凝集,用于检测抗红细胞不完全抗体。
直接Coombs试验:新生儿溶血症,自身免疫性溶血症,特发性自身免疫性贫血(患者红细胞上不完全抗体)
间接Coombs试验:检测母体Rh(D)抗体,红细胞不相容输血后产生的血型抗体测定(血清中游离的不完全抗体)
由于不完全抗体只能与一个RBC的决定簇结合,而不能同时与两个RBC的决定簇结合,而抗球蛋白抗体作为第二抗体可达到连接与RBC表面抗原结合的特异性抗体,使RBC凝集。
针对于不完全抗体(IgG抗体)的检测。

4 沉淀反应
0 沉淀反应
沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出的沉淀现象.根据沉淀反应介质和检测方法的不同,将其分为液体内沉淀试验、凝胶内沉淀试验和凝胶免疫电泳试验三大基本类型。
免疫浊法度测定为液体内沉淀试验;单向扩散试验平板法是一种定量的凝胶内沉淀试验,免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物,常见的有对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等。
【钩状效应:由抗原过量引起,导致形成的免疫复合物分子小,发生再解离,浊度下降,光散射减少的现象。
【海德堡曲线:抗体过量反应体系中,抗体过量时,免疫复合物形成随着抗原递增至抗原抗体比例最适合处达到最高峰,沉淀反应明显,而当抗原过量时,形成的免疫复合物逐渐减少,呈现一个抛物线形曲线。
1 (凝胶内沉淀实验)单向免疫扩散实验原理和应用Mancini曲线和Fahey曲线
原理:将一定量的抗体混于琼脂凝胶中,使待测抗原溶液在琼脂内由局部向周围自由扩散,在二者浓度比例合适处一定区域内形成可见的白色沉淀环。环的大小与抗原浓度成正相关。
Mancini曲线:大分子抗原(IgM)和长时间扩散(>48)的结果处理。K=C(抗原浓度)/d的平方(沉淀环直径)
Fahey曲线:小分子抗原和扩散时间较短(24h)的结果处理。K=logC/d
应用:原用于定量测定IgG、IgA、IgM、C3、C4、转帖蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等血浆蛋白。

2 双向免疫扩散实验应用
将抗原和抗体溶液分别放在凝胶的对应孔中,让两者在凝胶中自由扩散,当抗原与抗体相遇在浓度比例适当处形成可见的白色沉淀线。
应用:1)血清学诊断2)免疫化学分析:沉淀线位置主要与抗原、抗体两者浓度比例有关,沉淀线靠近抗原空,提示抗体含量高;靠近抗体空,提示抗原含量多。分子量大扩散慢,扩散圈小,形成的沉淀线弯向分子量大的一边。如二者分子量相对,则形成直线。3)抗体效价滴定:固定抗原浓度,稀释抗体;或抗原抗体双方做不同稀释,经自由扩散,一出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。4)分析抗原性质5)鉴定抗原或抗体纯度:多条沉淀线不纯

3 定向免疫扩散原理(对流免疫电泳,火箭免疫电泳)
定向免疫扩散:在电场作用下,抗原或抗体或二者在凝胶介质中定向移动发生的沉淀反应。
对流免疫电泳:将双向免疫扩散与电泳结合在直流电场中的定向加速的免疫扩散技术,常用语抗原或抗体定性分析、效价测定和纯度鉴定。
在pH8.6的巴比妥缓冲液制备琼脂凝胶板,抗体因等电点高、带微弱的负电荷,且分子量较大,因此在电场中的电泳力小于电渗力,泳向负极;而一般抗原蛋白带较强的负电荷,且分子量较小,电泳力大于电渗力,泳向正极。电泳时,抗原孔放于靠近负极一侧,抗体孔放于靠近正极的一侧,抗原抗体相对泳动,在两孔间相遇,比例合适时可形成肉眼可见的沉淀线。
火箭免疫电泳:在抗原电场作用下,在凝胶中定向移动、加速发生的单相免疫扩散。用于IgA、IgG、IgM和sIgA,不同成分C3、C4以及裂解产物AFP等血浆蛋白检测、
在琼脂糖凝胶板一端打孔、定量加样后,样品孔至于电泳槽负极端。抗原在电场作用下,并与凝胶中的抗体反应,逐渐形成梯度浓度,使沉淀带越来越窄,在抗原、抗体比例适当时形成火箭峰样沉淀,峰高低与抗原量呈正相关。

4 定向-自由联合免疫扩散(免疫电泳原理和应用)
免疫电泳:先将蛋白质抗原在凝胶中做区带电泳,根据其所带电荷、分子量和构型不同分成不可见的若干区带,然后沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽,加入相应抗血清,进行双向扩散,两者比例适合处形成弧形沉淀线。用于分析纯化后的抗原或抗体成分分析,粗略分析其纯度;正常及异常体液中免疫球蛋白的识别和鉴定:无丙种球蛋白血症、冷球蛋白血症、多发性骨髓瘤、白血病、系统性红斑狼疮、肝病等患者的血清蛋白成分的分析;多发性骨髓瘤血清M蛋白的检测和鉴定。
免疫固定电泳:在血清蛋白区带电泳后,将抗血清或浸透抗血清的乙酸纤维素或滤纸条放在区带表面而不是旁侧槽中,使抗体与对应抗原直接发生沉淀反应,使抗原被固定在电泳位置上,对样品中所含成分及其性质进行分析鉴定,用于鉴定迁移率相近的蛋白和M蛋白。

5 免疫浊度分析技术(液相中沉淀反应)原理、方法和分类;影响因素(心血管病、血液病、肾功能、神经系统。免疫功能。营养状态以及药物浓度的检测和分析)
原理:可溶性抗原与相应抗体特异结合,两者比例适合和增浊剂作用下,课快速形成一定大小的免疫复合物,使反应出现浊度。
免疫浊度分析影响因素(抗体的质量:特异性高、效价高、亲和力强和使用R型抗体,抗原抗体比例,反应的条件:pH6.5~8.5,,离子强度大,增浊剂,标本的因素)
透射免疫比浊法:当一定波长(340nm)的光线通过抗原抗体反应混合液时,由于抗原-抗体复合物形成使入射光被反射、吸收或散射而减弱,入社光被吸收的两与免疫复合物量呈正相关。【当抗体量保持过剩时,怎就抗原量导致免疫复合物增多、吸光度增强。加入增浊剂聚乙二醇(PEG)8000(消除蛋白质分子周围的电子云和水化层,促进特异性抗原、抗体分子靠近并结合成大分子复合物 终点法缩短反应时间,速率法 增加反应峰值)能加速免疫复合物形成。
散射免疫比浊法:用激光照射液相中抗原-抗体符合物微粒时部分光线发生散射,通过测定免疫复合物引起的光的散射强度(复合物大小、形状和输了)来测定抗原含量。【当抗体保持过剩,反应也中加入PEG,增加抗原量会导致散射光快速加强。【终点散射比浊法:当抗原抗体相遇后免疫反应立即开始,达到平衡10~30min在复合物聚合产生絮状沉淀之前。 速率散射比浊法:单位时间内抗原与抗体反应速度或免疫复合物形成的量;在抗体过量的情况下,随着抗原量增加,反应速度越来越快,棉衣服和物量也迅速增加,出现峰值所需时间随之缩短【25S】

6 抗原性质分析出现哪三种结果现象?结果解释?
形成的沉淀可出现:相吻、相交、相切三种现象
解释:互相吻合相连:抗体与两种抗原中的相同表位结合形成沉淀,但不能说明两种抗原完全相同
相交:两种抗原完全不同
相切:两种抗原部分相同

5 放射免疫技术:
【放射免疫技术:一放射性核素作为示踪物的一种免疫技术。
【放射性核素:自然条件下课发生自发性转化,由一种核素转变成另一种核素,并同时放出射线。
【放射性标记物:采用氯胺T方法将放射性核素链接在抗原或抗体分子上所形成的复合物
【比放射活性:单位质量标记物所含的放射性强度,每分子抗原评价所结合的放射性园子数目
【放射化学纯度:在标记物中结合在抗原上的放射活性占该标记物总放射活性的百分比
1 放射免疫分析RIA的原理、评价
原理:标记抗原和非标记抗原对限量特异性抗体的竞争结合反应。*AgAb信号强度与待测抗原呈反比例关系。用PEG沉降免疫复合物,倾倒过剩*Ag,测定沉淀物放射强度,绘制标准曲线。
评价:RIA敏感度高ug/L,与结构类似物质见的交叉反应少,特异性强,重复性好,批间批内误差小,标本用量少。【放射性核素易衰变,放射性标记物不稳定,试剂有效期短,核素易对环境和实验室造成污染。
2 免疫放射分析IRMA原理、评价
原理:以过量放射性标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应。固相抗原免疫吸附剂(【直接法检测半抗原。 双抗体夹心先用固相抗体与抗原反应,再与过量的标记抗体作用,形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物,反应平衡后洗涤除去游离的标记抗体,测定固相上的放射量【多价抗原)。Ag-*Ab的放射性强度与待测抗原量呈正比关系
评价:敏感性高,两个表位不易产生交叉反应,特异性。稳定性好,标记抗体和固相抗体均属过量,不易受外界影响,加样误差不大。抗体用量偏多,抗体特异性纯化较难。

3 相互比较,应用
IRMA&RIA被标记物:抗体,抗原。标记物用量:过量,定量较小。反应速率:快,稍慢。反应方式:非竞争性结合,竞争。特异性:高,稍差。抗原检测浓度范围:宽,较窄。分离技术:PEG-双抗体法,固相吸附法。应用范围:小分子半抗原,大分子抗原或抗体。
RIA应用:技术优势(灵敏度高,特异性高,商品化实际,适合测定小分子半抗原)临床应用(血清激素水平测定;病原体抗原或抗体测定,感染性疾病辅助诊断;血清肿瘤标志物测定,肿瘤辅助诊断和评价疗效;药物测定)

6荧光免疫技术
1 荧光基本知识,荧光物质
【荧光免疫技术:将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种免疫分析技术。
【荧光抗体染色技术:用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测。(荧光免疫显微技术:直接法、间接法、补体结合法和双标记法。)免疫荧光测定术:时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定。
【荧光猝灭:荧光分子在某些理化因素作用下,荧光分子的辐射能力受激发光较长时间的照射后会减弱的现象。
【荧光素:能产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物
【Stokes位移:选择荧光物质作为标记物时,激发光谱和发射光谱的波长差。
【荧光素影响因素:pH(荧光光谱改变,强度降低)、温度(20℃以上,荧光温度猝灭)、荧光素浓度、杂质(溶剂中不发光物质:溴化物、碘化物、氨基苯)、细胞固定剂、化合物(苯胺、酚、硝基苯、卤化物)
【FITC:异硫氰酸荧光素,黄绿色荧光,易溶于水和乙醇。RB200:四乙基罗丹明,不溶于水,溶于乙醇和丙醛,橘红色。TRITC四甲基异硫氰酸罗丹明,橙红色,与FITC配合用于双标记。PE:藻红蛋白,红色,流式荧光免疫技术中PE&FITC共用一个激发光。
【镧系稀土元素Eu3+螯合物激发光波长范围宽,发射光波长范围窄,荧光衰变时间长,用于时间分辨荧光免疫测定。
2 荧光标记物制备
荧光素标记抗体搅拌法:标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。
荧光素标记抗体纯化:透析法和凝胶柱层析法去除游离的荧光素,DEAT-纤维素离子交换层析去除未标记及过度标记的抗体。
镧系稀土元素标记物制备:元素离子不能直接与蛋白质结合,用有双功能基团的螯合剂,将稀土元素与抗体或抗原分子的氨基偶联。
常用螯合剂:多羧基类、白塔-二酮体类、BCPDA
标记方法:抗体和完全抗原直接标记,小分子半抗原先与大分子载体蛋白连接,再标记Eu3+
3 荧光免疫显微技术原理,评价,标本制作
原理:以荧光显微镜为检测工具,用荧光素标记特异性抗体或抗抗体,检测固定组织细胞上的抗原或血清中的抗体,常用于定性和定位检查。
标本制作:(组织切片、印片、涂片、单层培养细胞)(玻片:用无自发性荧光的优质玻片,厚度在 0.8至1.2mm;用无水乙醇和乙醚浸泡后使用)固定(作用 : ①防止标本从玻片上脱落; ②除去防碍抗原—抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果;③固定的标本易于保存,原则:①不能损伤细胞内的抗原;②不能凝集蛋白质;③不能损伤细胞形态;④固定后应保持细胞膜的通透性,以允许抗体进入与抗原结合。,染色,37℃30min,4℃过夜。
评价:组织学中抗原或抗体的定位、定性检查,高度特异性和形态直观。荧光容易消退,难以制备永久性标本,非特异荧光干扰。
4 间接免疫荧光法检测ANA原理和运用过程,判断
用荧光素标记抗体与标本中相应抗原反应,再用荧光素标记的第二抗体与抗原抗体复合物中的第一抗体结合,洗涤干燥后在荧光显微镜下观察特异性荧光,检测未知抗原或抗体。用于检测自身抗体,病原体检测,免疫病理分析。
5 荧光免疫测定技术(时间分辨荧光免疫测定)
时间分辨荧光免疫测定:以镧系元素标记抗体或抗原,并用时间分辨测定技术相结合的新型非放射性微量分析技术。
镧系元素荧光寿命长,10三次方到六次方倍,用时间分辨荧光测定仪延缓测量时间,可排除标本中非特异荧光干扰,得到稀土元素螯合物发射的特异性荧光。光谱激发光与荧光的波长差别明显,Eu3+被激发的荧光光带窄,发射峰尖锐,可在极窄的波长范围内测定。(时间延迟和波长分辨)

7 酶免疫技术:
1 基本概念
酶免疫技术:以酶为标记物,将酶催化底物的高效性和抗原抗体反应的特异性相结合的免疫技术。
【一步法优缺点:(简化流程,缩短试验时间)钩状效应:标本中待测抗原浓度过高,抗原较容易与酶标抗体结合,而未与固相抗体结合,,不能形成夹心复合物,最总测定结果低于实际含量。假阴性。

2 酶标记物制备(供氢体,波长)

HRP:辣根过氧化物酶,由糖蛋白和亚铁红素结合而成。
OPD:邻苯二胺,黄色,最大吸收波492nm
TMB:四甲基联苯胺,酶作用后天蓝色,加酸终止酶变黄色,450nm。
ALP:碱性磷酸酶;白塔-半乳糖苷酶:大肠埃希菌的四聚体蛋白,用于均相酶免疫测定。

3 ELISA酶联免疫吸附法原理、评价(双抗夹心法:两步法、一步法优缺点;间接法;竞争法;捕获法)

ELISA:把抗原或抗体结合到某种固相载体表面(免疫吸附),并将抗原或抗体与酶连接形成酶标记抗原或抗体(酶联),测定时将待测抗原或抗体和酶(标记)抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物,通过洗涤的方法将固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他成分分离,结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量形成一定比例,通过底物显色的方式定性或定量检测有色产物量即可确定样品中待测物质的含量。

①双抗体夹心法:测定大分子抗原,含有至少两个抗原决定簇的多价抗原。先将特异性抗体与固相载体结合,形成固相抗体;加入待测样本并温育,形成固相抗体抗原复合物,洗涤除去其他游离成分;然后加入酶标抗体温育,形成(固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物),洗涤除去游离酶标记抗体;加底物,根据产物显色程度进行抗原的定性或定量检测。

②间接法:检测抗体最常用。酶标抗体IgG

③竞争法:抗原和半抗原的定量检测。先用特异性抗体宝宝固相载体,然后同时加入待测抗原和酶标记抗原,待测样本中的抗原与酶标抗原竞争性的与固相载体上的特异性抗体结合,温育一定时间后洗涤,加底物显色,显色深浅与标本含量呈负相关。

④捕获法:血清中特定抗体Ig类别测定,病原体急性感染诊断中的IgM型抗体检测。首先将针对IgM的地儿抗体宝宝与固相载体形成固相抗体,加入待测标本后,标本中所有IgM即可被固相抗体捕获。第二步加入特异性抗原,其余固相载体上捕获的IgM特异性抗体结合,在加入针对特异性抗原的酶标记抗体,形成固相抗人μ链-IgM-抗原-酶标抗体复合物,加入底物显色。

3 包被概念和方法,封闭;抗体匹配试验

【包被:将抗体或抗原结合在固相载体上的过程。

【包被方法(加样,洗板):用包被缓冲液(pH9.6碳酸盐,pH7.4磷酸盐)将欲包被的抗原或抗体稀释到一定浓度(3~10ug/ml),包被提及为100~150ul/well。包被条件37摄氏度2~6h或4摄氏度过夜。用于包被的蛋白质浓度(10ng/ml-20ng/ml)不宜过大,以免形成多层聚集。

【封闭:1~5%牛血清白蛋白或5~20%小牛血清在包被一次反应板,高浓度蛋白占据空白位点(包被液蛋白浓度很低,造成固相载体表面常剩余少量未吸附位点,课非特异地吸附标本中的蛋白质及酶标记物,形成非特异性结合导致本底偏高)消除干扰。

【抗体匹配试验:双抗体夹心法测定抗原,当使用两种单克隆抗体作为固相抗体和酶标抗体时,需进行抗体匹配试验,一避免空间位阻等其他不利于夹心复合物形成的影响因素,获得较好的工作曲线。

4 免疫印迹实验原理、应用

【酶免疫印迹实验:以膜为固相载体将蛋白质抗原直接吸附或通过电转移方式转移至膜载体表面,形成固相抗原,加入特异性抗体和酶标记抗抗体,温育后形成免疫复合物存在于膜表面,加底物显色通过膜表面形成有色斑点或条带判定检测结果。(斑点酶免疫实验,酶免疫渗滤实验,酶免疫层析实验,免疫印迹实验)

【三个阶段:SDS-PAGE电泳分离蛋白质(阴电荷,聚丙烯酰胺凝胶,分子量越小,涌动速度越快。分子量大小分成若干区带),蛋白区带转印(电转移:凝胶-膜夹层组合完全浸入转印缓冲液中,放入铂丝电极的缓冲液槽;浸有转印缓冲液的吸水纸之间,两个石墨平板电极),免疫反应与显色(HRP底物为二氨基联苯胺DAB,棕色。不同分子量蛋白参照品,可确定各抗原租房分子量)。

【应用:均相酶免疫分析:药物等小分子物质的检测。ELISA:多种传染病的实验室诊断,病毒学检测、细菌学检测、免疫球蛋白、不同、肿瘤标志物检测。EIBT:抗原组分及其免疫活性分析,艾滋病,自身抗体谱测定,ENA。】

5 生物素-亲和素系统特点,相关酶免疫技术原理
【 BAS特点:特异性高,灵敏度高(亲和素同时与4个生物素分子结合,以及生物分子抗原或抗体可结合多个生物素分子产生级联放大效应),稳定性强(不可逆反应,抗酸碱能力强),实用性强(可与多种示踪物质如酶、荧光素、铁蛋白、放射性核素等联合用于抗原-抗体、配体-受体、核酸杂交等多种生物学反应体系,也可作为亲合介质用于上述反应物的分离、纯化。)。

【BAB法:以标记生物素分子为特点,以游离亲合素为桥,借助生物素化抗体连接抗原-抗体系统,借助生物素化酶连接信号检测系统。以游离亲和素剧中,分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素。

【LAB法:以标记亲和素为特点,将示踪物质(酶,荧光素)标记在亲和素分子上,借助生物素化抗体再与抗原-抗体系统进行偶联。

【ABC法:预先按一定比例将亲和素与生物素标记示踪物质混合,形成可溶性的亲和素-生物素化酶标复合物,同时确保预留一定位点再与生物素化的抗体结合,与抗原-抗体系统进行偶联。



发布时间: 2022-04-29 20:47:12